免疫螢光與流式細胞分析常遇到同一個問題：抗體的專一性已經確認，市面上卻沒有符合儀器通道或多色面板需求的螢光版本。傳統間接法可以利用二級抗體放大訊號，但也會增加孵育步驟、物種交叉反應與 multiplex 設計限制。Biotium Mix-n-Stain™ CF® Dye Antibody Labeling Kits 讓研究者把現有 IgG 直接轉換成共價螢光探針，原廠提供 5–20、20–50 與 50–100 µg 三種單次標記尺度。
直接標記改變了什麼？
直接標記省略二級抗體孵育與清洗，可在同一實驗中使用多支相同物種來源的一級抗體，也能縮短螢光團與抗原之間的距離。Mix-n-Stain™ 形成的是共價連結，多色染色時不會因非共價結合而發生染料轉移。
這項便利性不等於所有實驗都會得到更強訊號。間接法通常具有二級抗體帶來的訊號放大，低表現量標的改用直接法後可能較暗。選擇方法時要比較訊號雜訊比、抗原量、樣本自體螢光與儀器靈敏度，而不是只比較步驟數。
標記反應與 DOL 要怎麼理解？
試劑瓶內含預先定量的反應型 CF® Dye。IgG 與 Reaction Buffer 混合後加入染料瓶，染料會與抗體表面可反應的殘基形成穩定共價鍵。標記並不限定發生在 Fc 區；若反應位置靠近抗原結合區，仍可能影響親和力。
原廠手冊列出的典型平均標記程度約為每個抗體分子 4–6 個標記分子。這個數字是平均 DOL，不代表每一個抗體分子都帶有相同數量的染料，也不能直接等同於影像亮度。過高 DOL 可能造成自我淬熄、溶解性下降或結合能力改變；過低 DOL 則可能使訊號不足。
從相容性確認到染色：標準標記流程
下圖依原廠操作手冊 Protocol B 重整。15 分鐘指標記反應的孵育時間，不包含相容性檢查、必要的緩衝液置換與後續染色。IgM、Nanobody 不直接套用此流程。
- 完成原廠 pre-labeling checklist；標準流程以相容 buffer 中的 IgG 0.5–1.0 mg/mL 為起點。需要超濾時先依 Protocol A 處理。
- Reaction Buffer 與 Storage Buffer 回溫至室溫並短暫離心。每 9 µL 抗體液加入 1 µL 10X Reaction Buffer，使終濃度為 1X，充分混勻。
- 將混合液全量轉入染料瓶，短暫 vortex、spin down，於室溫避光孵育至少 15 分鐘。
- 依 kit 規格加入 Storage Buffer：5–20 µg 加 60 µL；20–50 µg 加 150 µL；50–100 µg 加 300 µL。此為額外加入量，不是最終體積，完成後可開始染色。
若 BSA／gelatin 對 IgG 的重量比大於 4:1，或抗體來自腹水，需依原廠 checklist 評估 Protocol C，以總蛋白量選 kit，不直接套用上述 IgG 計算。Storage Buffer 含 2 mM sodium azide，若下游涉及活細胞或功能性實驗，應先確認相容性與安全要求。
原廠規格
| 目標分子 | IgG 抗體；IgM、Nanobody 與其他蛋白質另有對應產品或流程 |
|---|---|
| 單次投入量 | 5–20 µg、20–50 µg或50–100 µg IgG |
| 建議抗體濃度 | 0.5–1.0 mg/mL |
| 反應時間 | 約15分鐘；人工操作時間少於30秒 |
| 標記後純化 | 不需要；游離標記在反應結束時不再具有反應性 |
| 典型平均 DOL | 每個抗體分子約4–6個標記分子 |
| 染料選擇 | 原廠現行貨號表列34種CF® Dye，涵蓋紫外光、可見光、far-red至near-IR |
| 內容物 | 反應型CF® Dye、10X Reaction Buffer、Storage Buffer、超濾離心管 |
| 緩衝液相容性 | 可耐受sodium azide、糖類及低量glycerol或Tris；BSA、gelatin與腹水需依modified protocol處理 |
| 用途限制 | 僅供研究使用；不供臨床診斷、治療或人體使用 |
原廠所稱的「100% recovery」是指免除標記後純化，避免抗體在純化步驟中的物理損失；它不是抗原結合活性百分之百保留的保證。名目投入量也不必然等於有效 IgG 量。若濃度來自總蛋白測量，BSA 等穩定蛋白可能被一併計入。
產品貨號與原廠連結
下表依 Biotium 現行產品頁整理。點選任何貨號可開啟對應染料的原廠產品頁；下單前仍需同時確認染料、抗體量與包裝次數。
| CF® Dye | Ex/Em | 5–20 µg | 20–50 µg | 50–100 µg | 3 × 5–20 µg |
|---|---|---|---|---|---|
| CF®350 | 347/448 nm | 92270 | 92250 | 92230 | — |
| CF®405S | 404/431 nm | 92271 | 92251 | 92231 | — |
| CF®405M | 408/452 nm | 92272 | 92252 | 92232 | — |
| CF®405L | 395/545 nm | 92303 | 92304 | 92305 | 92445 |
| CF®430 | 426/498 nm | 92316 | 92317 | 92318 | — |
| CF®440 | 440/515 nm | 92319 | 92320 | 92321 | — |
| CF®450 | 450/538 nm | 92322 | 92323 | 92324 | — |
| CF®488A | 490/515 nm | 92273 | 92253 | 92233 | 92446 |
| CF®514 | 516/548 nm | 92331 | 92332 | 92333 | — |
| CF®532 | 527/558 nm | 92289 | 92290 | 92291 | — |
| CF®543 | 541/560 nm | 92287 | 92267 | 92247 | — |
| CF®555 | 555/565 nm | 92274 | 92254 | 92234 | — |
| CF®568 | 562/583 nm | 92275 | 92255 | 92235 | 92447 |
| CF®570 | 568/591 nm | 92334 | 92335 | 92336 | — |
| CF®583 | 583/606 nm | 92337 | 92338 | 92339 | — |
| CF®583R | 586/609 nm | 92455 | 92456 | 92457 | — |
| CF®594 | 593/614 nm | 92276 | 92256 | 92236 | 92448 |
| CF®597R | 597/619 nm | 92461 | 92462 | 92463 | — |
| CF®633 | 630/650 nm | 92277 | 92257 | 92237 | — |
| CF®640R | 642/662 nm | 92278 | 92258 | 92245 | — |
| CF®647 | 650/665 nm | 92279 | 92259 | 92238 | 92449 |
| CF®660R | 663/682 nm | 92281 | 92261 | 92243 | — |
| CF®660C | 667/685 nm | 92280 | 92260 | 92239 | — |
| CF®680 | 681/698 nm | 92282 | 92262 | 92240 | — |
| CF®680R | 680/701 nm | 92283 | 92263 | 92246 | — |
| CF®700 | 695/720 nm | 92425 | 92426 | 92427 | — |
| CF®710 | 712/736 nm | 92579 | 92580 | 92581 | — |
| CF®725 | 729/750 nm | 92582 | 92583 | 92584 | — |
| CF®740 | 742/767 nm | 92576 | 92577 | 92578 | — |
| CF®750 | 755/779 nm | 92284 | 92264 | 92241 | — |
| CF®770 | 770/797 nm | 92285 | 92265 | 92242 | — |
| CF®790 | 784/806 nm | 92288 | 92268 | 92248 | — |
| CF®800 | 797/816 nm | 92428 | 92429 | 92430 | — |
| CF®820 | 822/835 nm | 92431 | 92432 | 92433 | — |
貨號與光譜依 Biotium 原廠產品頁於 2026-11-12 所列資料整理。該頁文字介紹仍寫 31 種染料，但同頁現行貨號表可逐項核對到 34 種；本文以貨號表為準。原廠可能調整供應狀態，正式訂購以當次詢價與原廠確認為準。
適合的科學應用
流式細胞分析
直接標記可減少二級抗體交叉反應，適合建立多色表面或胞內標記面板。實驗需配置未染色、單色補償或光譜解混控制，並使用適當同型或 FMO control 判讀背景。
免疫螢光與共軛焦顯微鏡
研究者可把既有一級抗體轉換成不同顏色的探針，用於定位與共定位分析。組織或細胞自體螢光偏高時，可優先評估紅光或 far-red 染料；藍光染料較容易受到組織自體螢光影響。
多重免疫染色
多支一級抗體來自同一物種時，可分別標上不同 CF® Dye，避開二級抗體的物種限制。每支抗體都應個別確認標記後的結合功能，再組合成 panel，避免把單色成功直接推定為多色條件也會成功。
高解析與超解析成像
直接標記可降低二級抗體造成的空間位移。若研究目標是 STORM，應改用原廠專用 Mix-n-Stain™ STORM CF® Dye Antibody Labeling Kits；一般版本的平均 DOL 未必符合單分子定位需求。
標記前的可重現性檢查
- 記錄抗體名稱、clone、lot、純度、濃度與原始緩衝液。
- 以實際 IgG 量選擇試劑規格，不把含 BSA 樣品的總蛋白量直接當成 IgG 量。
- 確認 glycerol、Tris、glycine、BSA、gelatin 或腹水是否需要超濾或 modified protocol。
- 固定反應溫度、時間、混合方式與 Storage Buffer 加入量。
- 以未標記抗體或既有合格 conjugate 比較抗原結合能力與背景。
- 固定染色濃度、孵育、洗滌、曝光、雷射功率或流式電壓設定。
- 記錄標記抗體的保存條件、避光方式及凍融次數。
選型邊界
標準 Mix-n-Stain™ CF® Dye Antibody Labeling Kits 是為 IgG 設計。IgM、Nanobody、其他蛋白質與體內成像各有專用產品。若要標記約 1 mg 蛋白質、移除游離染料，或自行最佳化 dye-to-protein ratio，可評估 CF® Dye & Biotin SE Protein Labeling Kits。產品僅供研究使用，保存、安全與廢棄處理應依實際貨號的 Product Information 與 SDS 執行。
本文依 Biotium Mix-n-Stain™ CF® Dye Antibody Labeling Kits 產品頁、原廠操作手冊與Antibody & Protein Labeling Kits 技術頁整理。所有數據均應視為原廠條件下的產品資訊；實際表現需由目標抗體、樣本與儀器條件驗證。