RNA-seq 可以顯示哪些基因的轉錄量改變，卻不一定直接回答是哪種組蛋白修飾或染色質蛋白占據了相關 DNA。CUT&RUN 與 CUT&Tag 都先讓抗體在細胞或細胞核內辨識目標，再把切割酵素帶到抗體所在位置。這像是由抗體替酵素指定地址，只處理目標附近的 DNA，而不是先將整個基因組打碎再尋找片段。EpiCypher 分別提供 CUTANA™ ChIC/CUT&RUN Kit 與 CUTANA™ CUT&Tag Kit 支援這兩條工作流程。
CUT&RUN：切割後釋放目標附近 DNA
CUT&RUN 是 Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease 的縮寫。細胞或細胞核固定在 Concanavalin A 磁珠上並經 digitonin 通透化；目標抗體結合組蛋白修飾、轉錄因子或其他染色質蛋白後，protein A/G-MNase 融合蛋白（pAG-MNase）被帶到該位置。加入 Ca²⁺ 啟動 MNase，目標附近的 DNA 被切割並釋放至上清液，接著純化 DNA，再進行獨立的 end repair、接頭連接及索引 PCR。
這個流程的產物是富集 DNA，不是已完成的定序文庫。若要由細胞一路做到 Illumina 文庫，還需搭配 CUT&RUN Library Prep Kit 或相容的低輸入文庫製備方法。
CUT&Tag：切割時同步加入定序接頭
CUT&Tag 是 Cleavage Under Targets and Tagmentation 的縮寫。抗體定位後加入預載定序接頭的 pAG-Tn5；Mg²⁺ 啟動 Tn5 時，它同時切割目標附近 DNA 並插入接頭。EpiCypher 的 Direct-to-PCR 設計可在反應混合物中直接加入索引引子與 PCR 主混合液，再純化擴增後文庫，減少轉管與傳統文庫製備步驟。
流程較短，不代表所有目標都適用。Tn5 可能作用於開放染色質或粒線體 DNA，細胞核完整性、高鹽洗滌、抗體品質與 PCR 循環數都可能改變背景及重複讀段比例。
原廠規格
| 項目 | CUTANA ChIC/CUT&RUN Kit | CUTANA CUT&Tag Kit |
|---|---|---|
| 現行版本 | Kit Version 6 | Kit Version 4 |
| 貨號與反應數 | 14-1048-24rxn／48rxn | 14-1102-24s3／48s1／48s2 |
| 核心酵素 | pAG-MNase，以 Ca²⁺ 啟動 | 預載接頭的 pAG-Tn5，以 Mg²⁺ 啟動 |
| 原廠建議輸入 | 由 500,000 個細胞開始 | 每次 100,000 個 native nuclei |
| 原廠低輸入資料 | 可低至 5,000 個細胞，須依目標驗證 | 可低至 10,000 個細胞核取得相近資料 |
| 主要目標 | 組蛋白 PTM、轉錄因子、reader、writer、eraser、remodeler | 以組蛋白 PTM 為主 |
| 樣品型態 | native、冷凍或輕度交聯的細胞與細胞核 | native nuclei 為標準；亦驗證全細胞、冷凍及輕度交聯樣品 |
| 文庫製備 | 富集 DNA 需另行製作文庫 | 套組含 Direct-to-PCR、索引引子與文庫純化試劑 |
| 原廠定序規劃 | 約 3–8 million reads／sample | 約 5–8 million reads／sample |
| 控制組 | H3K4me3、H3K27me3、IgG、K-MetStat spike-in | H3K4me3、H3K27me3、IgG、K-MetStat spike-in |
| 保存 | 組件依標示置於室溫、4°C或−20°C；到貨後穩定12個月 | 組件依標示置於室溫、4°C或−20°C；到貨後穩定12個月 |
低輸入數字代表原廠曾在指定條件取得可用資料，不是每種細胞與抗體的保證下限。定序深度也是規劃起點：狹窄的 H3K4me3 peak、廣域的 H3K27me3 domain與低豐度蛋白可能需要不同 reads 數、peak caller及品質標準。
應用差異：研究目標比流程速度更重要
| 研究情境 | 建議方法 | 判斷理由 |
|---|---|---|
| 新接觸染色質圖譜 | CUT&RUN | 原廠定位為目標相容性較廣、較穩健的主力方法 |
| 組蛋白修飾分析 | 兩者皆可 | 樣品充足或需跨目標比較可選 CUT&RUN；低輸入與快速建庫可評估 CUT&Tag |
| 轉錄因子定位 | CUT&RUN | 現行 CUT&Tag 套組不建議用於一般染色質相關蛋白 |
| reader、writer、eraser、remodeler | CUT&RUN | 對不同蛋白目標與較弱染色質交互作用較具彈性 |
| 珍貴低量樣品 | CUT&Tag 可優先評估 | 建議輸入較低，Direct-to-PCR 可減少文庫製備損失 |
| 大量樣品的 histone PTM 研究 | CUT&Tag | 切割與加接頭同步，適合多重索引及高通量處理 |
| 難以取得完整細胞核 | CUT&RUN | CUT&Tag 較依賴細胞核品質，也要控制開放染色質與粒線體背景 |
三類常見研究應用
啟動子與活性基因
H3K4me3 常富集於活躍基因的轉錄起始位置。兩種方法都可用於此目標，但需配置 H3K4me3 陽性控制、IgG 陰性控制及生物複本，並以 TSS 附近富集、FRiP 與複本相關性判斷品質。
增強子與細胞狀態
H3K4me1與H3K27ac可協助描述增強子狀態。若研究包含大量處理條件或少量分選細胞，CUT&Tag可縮短文庫流程；若還要分析調控蛋白，CUT&RUN較容易維持相同方法架構。
抑制性染色質
H3K27me3 等標記常形成廣域富集區。分析時不能直接沿用轉錄因子的尖銳 peak 參數，應使用適合 broad domain 的設定，並比較陽性控制、IgG 背景及生物複本。
轉錄因子與染色質調控蛋白
CTCF、轉錄因子、染色質重塑酵素與表觀遺傳 reader／writer 是 CUT&RUN 較合適的目標。抗體即使能用於 Western blot 或 ChIP-seq，也不保證可在 CUT&RUN 中有效辨識表位並招募 pAG-MNase，仍須直接驗證。
名目細胞數不等於有效反應輸入
放入100,000個細胞核，不代表每個細胞核都保持完整、被ConA磁珠回收、成功通透化並接受有效酵素作用。冷凍、交聯、細胞核萃取、團聚與磁珠損失都會降低有效輸入。低細胞數實驗還容易增加PCR重複與取樣偏差，不能只用文庫濃度判定成功。
文獻支持到哪裡
An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites（2017）↗
這篇原始研究建立 CUT&RUN 的抗體導向 MNase 切割原理，支持其低背景與蛋白質—DNA定位能力；它不是現行EpiCypher Kit Version 6的產品比較試驗。
CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells（2019）↗
研究證明CUT&Tag可用於低細胞數及單細胞染色質分析。文獻中的方法彈性不等於現行商業套組已驗證所有目標；EpiCypher目前仍將該套組主要定位於histone PTM。
使用前的再現性檢核
- 記錄細胞或細胞核來源、數量、活性、保存方式、交聯條件與細胞核完整性。
- 保存抗體 clone、批號、加入量，以及在 CUT&RUN 或 CUT&Tag 中的直接驗證資料。
- 每批加入陽性控制、同物種 IgG 陰性控制、適當的無一級抗體控制及 K-MetStat spike-in。
- 記錄 ConA 磁珠、digitonin、pAG-MNase或pAG-Tn5的批號與反應條件。
- 固定Ca²⁺或Mg²⁺啟動時間、溫度、洗滌鹽濃度及操作順序。
- 檢查PCR循環數、文庫濃度、片段分布、duplicate rate、粒線體reads與比對率。
- 保存FRiP、peak數量、生物複本相關性、genome build、排除區域及peak caller版本。
- 若更換細胞型態、目標或抗體，重新建立對照基準，不沿用舊批次的成功假設。
選型觀點
若目標是轉錄因子、染色質酵素或尚未建立的新標的，CUT&RUN 是較合理的起點。若研究集中在 histone PTM、樣品量有限，或需要快速處理大量樣品，CUT&Tag 可減少文庫製備步驟，但要更嚴格監控細胞核品質、Tn5背景與PCR重複。選擇標準不是哪一種方法較新，而是哪一種酵素、樣品格式與控制設計能直接回答研究問題。
本文依 EpiCypher CUTANA ChIC/CUT&RUN Kit、CUTANA CUT&Tag Kit及原廠方法比較整理。套組版本、內容物、建議輸入量、保存期限與操作條件應以到貨標示及對應版本手冊確認。產品僅供研究使用，不應直接用於人體或動物的診斷、治療或臨床用途。