兩群 CD8⁺ T 細胞可能具有相近的 PD-1 表現量，訊號反應卻不相同。原因之一是細胞膜上的受體並非均勻散開：同種蛋白可能形成聚集，不同受體也可能出現在相近的膜區域。Flow cytometry、CyTOF 與 CITE-seq 擅長回答「每個細胞有哪些蛋白、各有多少」，但通常不直接描述這些蛋白在單一細胞表面的鄰近關係。Pixelgen Proxiome Kit v2, Immuno 155 v2 將問題延伸到蛋白如何共同組織。
PNA 如何把空間鄰近轉成序列資料？
Proximity Network Assay（PNA）先以帶有 DNA barcode 的抗體標記細胞表面蛋白，再在細胞上進行 rolling circle amplification（RCA）。Linker oligonucleotides 連接鄰近的 RCA 產物，讓蛋白身分與局部鄰近關係被寫入可定序的 DNA 分子。次世代定序（NGS）讀出連結後，Pixelator 將序列整理成每個細胞的 proximity network，並計算 protein abundance、同種蛋白 clustering 與不同蛋白 colocalization。
這不是顯微鏡影像。原廠標示的約 50 nm 是分析所對應的奈米尺度，不表示系統會輸出具有 50 nm 光學解析度的細胞照片。Colocalization 也代表在此 assay 與統計模型下呈現鄰近，不能單獨證明兩種蛋白直接結合；需要時仍應搭配免疫沉澱、功能擾動或成像方法驗證。
三種讀值必須一起判讀。某蛋白 abundance 增加時，觀察到鄰近連結的機會也可能上升，不宜直接把較高 colocalization 解讀為新的功能複合體。比較組應維持一致的細胞類型、分子計數、批次與正規化方式。對低表現標的而言，沒有偵測到鄰近訊號也不等於關係不存在，還可能受到抗體親和力、epitope 可及性及定序深度影響。
原廠規格
| 項目 | 原廠列示內容 |
|---|---|
| 產品 | Pixelgen Proxiome Kit v2, Immuno 155 v2 |
| 反應數／料號 | 8：PROXIMM0028；16：PROXIMM00216；32：PROXIMM00232 |
| 物種與標的 | Human；155 種免疫細胞表面蛋白，另含 3 個 controls |
| 主要讀值 | 單細胞 protein abundance、clustering、colocalization 與 proximity network |
| 空間尺度 | 原廠標示 nanoscale，約 50 nm |
| 細胞輸入／輸出 | 由 50,000 cells/sample 起；data output 1,000 cells/sample |
| 樣本 | 活體或冷凍 PBMC、骨髓、滑液、分離免疫細胞、cell lines，以及由類器官或新鮮冷凍組織解離的細胞等 |
| 通量與延伸 | 最高 64 samples/experiment；最多 2 個 custom antibodies 與 2 個 CAR-specific detection reagents |
| 定序與分析 | Illumina、MGI、Roche、Ultima Genomics、AVITI；Pixelator |
50,000 個輸入細胞不等於 1,000 個有效網路
「由 50,000 cells 起」是上樣需求，「1,000 cells/sample」是原廠列示的資料輸出，兩者不是回收率換算。固定、染色、清洗、RCA、連結、library preparation、定序深度及 Pixelator 品質篩選，都可能改變最終可分析的細胞數。研究計畫應分別記錄起始細胞數、處理後存活與損失、library QC、reads per cell、通過篩選的細胞數，以及各細胞的網路複雜度。
研究應用與必要控制
CAR-T 與細胞治療
CAR-positive 比例相近的兩批細胞，仍可能具有不同的 CAR clustering 或 CAR-centered colocalization network。可比較不同 construct、製程批次、刺激前後或治療時間點；讀值包含 CAR abundance、聚集與鄰近蛋白網路。實驗需固定培養與活化條件，並保留 viability、傳統表面表型及未刺激控制。CAR-T 縱向重塑目前已有公開 preprint，屬早期研究證據，不能視為臨床效能驗證。
免疫腫瘤與 checkpoint biology
PBMC、分離 T／NK 細胞或解離後的腫瘤浸潤免疫細胞，可用來比較活化、耗竭或藥物處理前後的受體組織。PD-1 表現量未改變時，其周圍蛋白網路仍可能變化。分析應同時呈現 abundance 與 colocalization，避免把細胞族群比例改變誤認為單一細胞的膜重組。
血液疾病與藥物作用機制
骨髓、PBMC 或白血病 cell line 可比較治療前後的 cell-surface interactome。若藥物造成細胞死亡或選擇性淘汰某一亞群，網路差異可能來自組成變動，而非受體重新排列；需要 vehicle、劑量、時間、存活率與細胞類型分層控制。
自體免疫與感染研究
滑液或周邊血免疫細胞可用於研究疾病活動度、刺激或治療前後的表面蛋白組織。臨床來源樣本必須控制採集時間、保存、凍融與批次效應，並依倫理審查及受試者同意使用。
文獻證據應如何解讀？
Karlsson 等人在 Nature Methods 發表的 Molecular Pixelation 研究使用第一代 MPX 與 76-protein panel，證明 DNA-based proximity information 可重建單細胞表面蛋白的空間網路。這篇同行評審論文支持方法學原理，但不是現行 Proxiome Kit v2, Immuno 155 v2 的直接產品比較或效能驗證。
Pixelgen 的文獻頁另列出 PNA、CAR-T 與血液疾病研究，其中部分仍為 preprint。正式引用時應清楚標示是否經同行評審，並區分產品使用、方法可行性與疾病結論三種證據層級。
可重現性檢核
- 樣本歷史：記錄來源、細胞亞群、採集至處理時間、凍融、活率與固定條件。
- 操作者變因：固定細胞計數、抗體染色、洗滌、RCA、linking 與移液時間。
- 試劑狀態：保存 kit、barcoded antibodies、custom／CAR reagents 的批號、效期與溫度紀錄。
- 定序設定：記錄平台、read configuration、library concentration、定序深度與 batch layout。
- 分析版本：保存 Pixelator 版本、參數、參考 panel、過濾門檻與原始 FASTQ。
- 品質終點：同時報告輸入與輸出細胞數、reads per cell、網路複雜度、陰性控制及批次一致性。
選型判斷
若研究目標只是快速量測少量 marker 的表現量，flow cytometry 通常較直接；若需要 RNA 與表面蛋白聯合分析，可評估 CITE-seq；若問題涉及組織切片中的原位座標，則應選擇 tissue spatial platform。Proxiome 的位置是在解離後的單一人類免疫細胞上，以高 multiplex 解析表面蛋白 abundance、clustering 與 colocalization。選擇它的理由應是研究問題需要 proximity network，而不是只因 panel 有 155 個標的。
本文依 Pixelgen Proxiome Kit v2 官方產品頁、產品總覽、使用手冊入口與公開文獻整理。產品規格與用途屬原廠陳述；方法限制、控制與選型為科學解讀。料號、panel、相容樣本、軟體與定序條件可能更新，採購或設計實驗前應以最新 user manual、product sheet 與原廠確認為準。本文僅供研究用途資訊，不作為臨床診斷或治療依據。